Uso della tecnica di HRM (High Resolution Melt) PCR per la caratterizzazione della flora microbica dominante di alcuni prodotti alimentari

Le metodiche di PCR tradizionali di caratterizzazione microbica nel settore alimentare sono generalmente laboriose e richiedono tempo da parte dell’operatore. In questo lavoro di tesi sono stati messi a punto dei protocolli di qPCR HRM per la caratterizzazione dei consorzi microbici dei batteri totali, della famiglia Lactobacillaceae e dei lieviti in differenti matrici alimentari. Lo scopo è quello di far risaltare la capacità diagnostica della tecnica high resolution melt (HRM) a partire dal DNA estratto direttamente dagli alimenti, sfruttando la capacità della tecnica di riconoscere piccole variazioni di temperature di fusione degli ampliconi basandosi su differenze di poche paia di nucleotidi. Sono state analizzate 3 differenti matrici alimentari: dei prodotti da forno fermentati con tecnica sourdough ottenuti da differenti farine; del latte vaccino crudo e trattato; degli integratori proteici vegetali. Il DNA microbico è stato estratto con tre differenti kit commerciali di estrazione per ognuno dei tre ecosistemi alimentari da saggiare. Con la tecnica qPCR è stato possibile quantificare i tre differenti gruppi microbici nei campioni saggiati, anche per quei campioni con una bassa carica microbica o con un DNA di purezza ridotta. Tuttavia con la metodologia HRM non sono stati ottenuti risultati soddisfacenti per tutti i campioni. Non è stato possibile caratterizzare alcuni campioni per certi target microbici, per la loro ridotta abbondanza. Inoltre il DNA di bassa qualità, dovuto al forte contenuto proteico della matrice di alcuni campioni ha inciso sulle reazioni HRM risultando in curve di melt frastagliate e non processabili. In conclusione, per un’efficace analisi di HRM sono fondamentali un target di reference di peso simile a quello del DNA dei campioni da saggiare e un DNA di ottima qualità con valori di rapporto λ 230/260 compresi tra 1.6 e 2.