Implementation, set up and validation of multiplex qualitative two-step RT-PCR based on TaqMan® method for the diagnosis of viruses in Vitis vinifera L.

La viticoltura si trova ad affrontare il problema dalla lotta contro i patogeni che comporta costi ingenti dovuti anche alla sostituzione di piante infette. Le patologie più gravi sono l’Infezione degenerativa, l’Accartocciamento fogliare e il Complesso del legno riccio, tutti causati da infezioni virali. L’impresa cilena Concha y Toro ha deciso di studiare la presenza dei virus all’interno dei propri vigneti in modo da evitarne la diffusione, applicando la tecnica analitica della Real Time PCR, strategia SYBR® Green e TaqMan®. L’obiettivo di questa ricerca è di mettere a punto un protocollo che permetta di rilevare la presenza dei virus applicando una strategia multiplex, al fine di ridurre i costi e i tempi di analisi. Inoltre è possibile inserire un controllo interno che assicuri la veridicità di una risposta negativa alla presenza del virus. Sono state costruite curve standard per le analisi in singleplex dei virus testati dall’azienda e del gene actina di vite, allo scopo di ottimizzare l’analisi. È seguito lo studio delle analisi in duplex prima con l’introduzione del controllo interno e in seguito con test per analizzare combinazioni di virus. Sono state confrontate le efficienze delle curve standard verificando che il valore rimanesse all’interno di un range stabilito e che non ci fosse differenza significativa tra l’analisi in singleplex e la corrispondente in duplex. Lo stesso è stato ripetuto per un protocollo in triplex. Sono state studiate la sensibilità e la specificità di ogni analisi in modo da validare il metodo. I risultati ottenuti hanno dato la possibilità di ottimizzare i protocolli singleplex e confermato la possibilità di introdurre il gene actina come controllo interno nelle analisi. Sono stati raggiunti ottimi risultati anche in molte delle combinazioni in duplex tra virus. In futuro sarà necessario approfondire lo studio delle sensibilità e specificità d’analisi in modo da validare il metodo evitando falsi negativi o falsi positivi.