Sovraespressione, purificazione e caratterizzazione cinetica della polimerasi DnaE di Deinococcus radiodurans

Perrone, Alessandro (2016) Sovraespressione, purificazione e caratterizzazione cinetica della polimerasi DnaE di Deinococcus radiodurans. [Laurea magistrale], Università di Bologna, Corso di Studio in Chimica industriale [LM-DM270], Documento ad accesso riservato.
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Abstract

Il passo preliminare del presente elaborato è quello di mettere a punto un metodica solida e riproducibile per la sovraespressione della subunità α di D. radiodurans per via eterologa. L’ospite ideale per realizzare la sovraespressione è E. coli, microorganismo ampiamente discusso e impiegato per via della sua semplice manipolazione. Per realizzare la sovraespressione il ceppo di E. coli prescelto è stato trasformato con il plasmide pBAD-dnaE e la proteina in esame è stata ottenuta come corpi di inclusione (biologicamente inattiva). Successivamente alla fase di rinaturazione e alla purificazione tramite cromatografia liquida dell’enzima è stato possibile ottenere quantità sufficienti di proteina pura e biologicamente attiva con la quale condurre saggi spettrofotometrici di attività enzimatica per valutare il comportamento dell’enzima in vitro simulando le condizioni di substrato attese in vivo. È proprio in quest’ultimo frangente che si condensa lo scopo di questo lavoro. La conduzione dei saggi di attività enzimatica in condizioni ricombinative e non ricombinative (quindi in presenza o meno di RecAEc nell’ambiente di reazione) ci ha consentito di comprendere meglio il comportamento della pol III-α durante la fase di strand invasion mediata dalla ricombinasi e la successiva sintesi del neofilamento, contribuendo a chiarire alcuni aspetti dei meccanismi che intervengono lungo la via di riparazione del genoma danneggiato in D. radiodurans ancora poco discussi. Inoltre l’elaborazione di un sistema di espressione per la singola subunità α getterebbe le basi per sviluppare un sistema di co-espressione più complesso ove siano coinvolte anche altre subunità dell’oloenzima (τ-δ-δ’), in modo da poter verificare la tipologia di subassemblaggio che spontaneamente avverrebbe in vivo e gli stimoli relativi tra le diverse subunità che ne migliorerebbero l’efficienza.

Abstract
Tipologia del documento
Tesi di laurea (Laurea magistrale)
Autore della tesi
Perrone, Alessandro
Relatore della tesi
Scuola
Corso di studio
Parole chiave
polimerasi III subunità alpha Deinococcus radiodurans sovraespressione corpi di inclusione purificazione caratterizzazione cinetica
Data di discussione della Tesi
17 Marzo 2016
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